{"id":58638,"date":"2017-01-27T11:00:17","date_gmt":"2017-01-27T14:00:17","guid":{"rendered":"https:\/\/espacoecologico.com.br\/arquivo\/?p=58638"},"modified":"2017-01-26T21:08:02","modified_gmt":"2017-01-27T00:08:02","slug":"novo-metodo-permite-editar-o-genoma-do-parasita-causador-da-doenca-de-chagas","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/espacoecologico.com.br\/arquivo\/novo-metodo-permite-editar-o-genoma-do-parasita-causador-da-doenca-de-chagas\/","title":{"rendered":"Novo m\u00e9todo permite editar o genoma do parasita causador da doen\u00e7a de Chagas"},"content":{"rendered":"

\"\"<\/a>T\u00e9cnicas que permitem manipular o genoma de parasitas causadores de doen\u00e7as \u2013 para, por exemplo, inibir a express\u00e3o de prote\u00ednas e investigar sua fun\u00e7\u00e3o \u2013 t\u00eam sido amplamente empregadas pelos cientistas na tentativa de identificar alvos para o desenvolvimento de f\u00e1rmacos.<\/p>\n

Enquanto avan\u00e7os t\u00eam sido alcan\u00e7ados no estudo do Trypanosoma brucei<\/i> (causador da doen\u00e7a do sono) ou do Toxoplasma gondii<\/i> (causador da toxoplasmose), por exemplo, no caso do Trypanosoma cruzi<\/i> (causador da doen\u00e7a de Chagas) os m\u00e9todos tradicionalmente usados para nocautear genes ou marcar prote\u00ednas intracelulares v\u00eam se revelando ineficazes.<\/p>\n

Com apoio da FAPESP, por meio do Projeto Tem\u00e1tico \u201cSinaliza\u00e7\u00e3o por \u00edons de c\u00e1lcio em tripanosomat\u00eddeos<\/b><\/a>\u201d, um grupo coordenado pelo professor Roberto Docampo na Faculdade de Ci\u00eancias M\u00e9dicas da Universidade Estadual de Campinas (FCM-Unicamp) mostrou ser poss\u00edvel manipular o genoma do T. cruzi<\/i> por meio do chamado sistema CRISPR\/Cas9 (do ingl\u00eas, clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated gene 9<\/i>).<\/p>\n

Docampo \u00e9 professor da Universidade da Georgia, nos Estados Unidos, e mant\u00e9m colabora\u00e7\u00e3o com o professor da Unicamp An\u00edbal Vercesi<\/b><\/a> h\u00e1 mais de 25 anos, quando descobriram no T. cruzi<\/i> uma nova organela chamada acidocalcisoma, que est\u00e1 envolvida na regula\u00e7\u00e3o dos n\u00edveis de c\u00e1lcio dentro da c\u00e9lula. Ele coordena o Tem\u00e1tico no \u00e2mbito do Programa S\u00e3o Paulo Excellence Chair (SPEC), desenvolvido no laborat\u00f3rio de Vercesi na Unicamp.<\/p>\n

A metodologia CRISPR\/Cas9 consiste em transfectar ( introduzir intencionalmente \u00e1cido nucleicos nas c\u00e9lulas) o parasita com um vetor \u2013 no caso uma pequena mol\u00e9cula circular de DNA chamada plasm\u00eddeo \u2013 de modo a induzir a express\u00e3o de duas outras mol\u00e9culas: a enzima Cas9 e o sgRNA, que ir\u00e3o se unir no n\u00facleo celular para formar uma ribonucleoprote\u00edna. A Cas9 \u00e9 uma endonuclease, ou seja, uma prote\u00edna capaz de produzir uma quebra na dupla fita de DNA. O sgRNA \u00e9 uma esp\u00e9cie de RNA-guia, que serve para dirigir essa enzima para o gene-alvo. Dessa forma, \u00e9 poss\u00edvel introduzir ou suprimir material gen\u00e9tico no local onde o DNA foi quebrado. Al\u00e9m do plasm\u00eddeo, tamb\u00e9m \u00e9 transfectada uma mol\u00e9cula de DNA doadora que permite o reparo da dupla fita.<\/p>\n

\u201cEsse processo foi inicialmente descrito<\/b><\/a> como sendo um sistema imune rudimentar de bact\u00e9rias e, mais tarde, foi adaptado<\/b><\/a> para a edi\u00e7\u00e3o do genoma em organismos eucariotos. Atualmente, \u00e9 poss\u00edvel us\u00e1-lo em praticamente qualquer tipo de organismo\u201d, contou Noelia Lander, p\u00f3s-doutoranda na FCM-Unicamp.<\/p>\n

Em uma pesquisa divulgada<\/b><\/a> na revista mBio<\/i> em 2015, o grupo da Unicamp mostrou, pela primeira vez, ser poss\u00edvel usar o sistema CRISPR\/Cas9 para nocautear genes do T. cruzi<\/i>.<\/p>\n

Mais recentemente, em artigo publicado<\/b><\/a> no The Journal of Biological Chemistry (JBC)<\/i>, a equipe validou o m\u00e9todo tamb\u00e9m para a marca\u00e7\u00e3o de prote\u00ednas \u2013 processo que permite estabelecer sua localiza\u00e7\u00e3o no interior das c\u00e9lulas e identificar vias de sinaliza\u00e7\u00e3o importantes para a sobreviv\u00eancia do parasita.<\/p>\n

\u201cFizemos o que se chama de marca\u00e7\u00e3o C-terminal de prote\u00ednas, que consiste em acrescentar \u00e0 cadeia polipept\u00eddica uma pequena mol\u00e9cula, como a hemaglutinina (HA), contra a qual j\u00e1 existem anticorpos comerciais espec\u00edficos. Os anticorpos reconhecem a mol\u00e9cula, ligam-se a ela e, por meio de microscopia de fluoresc\u00eancia, \u00e9 poss\u00edvel localizar a prote\u00edna que estamos estudando na c\u00e9lula\u201d, explicou Lander.<\/p>\n

Inicialmente, para confirmar se a t\u00e9cnica de fato funcionava com o T. cruzi<\/i>, o grupo usou o sistema CRISPR\/Cas9 para marcar a prote\u00edna TcVP1 (pirofosfatase vacuolar de pr\u00f3tons), cuja localiza\u00e7\u00e3o j\u00e1 era conhecida.<\/p>\n

\u201cEla est\u00e1 presente no acidocalcisoma. J\u00e1 existem anticorpos espec\u00edficos contra essa prote\u00edna TcVP1 e eles apontaram para a mesma localiza\u00e7\u00e3o que a observada quando usamos o m\u00e9todo CRISPR\/Cas9\u201d, contou Lander.<\/p>\n

Em seguida, o sistema CRISPR\/Cas9 foi usado para marcar e localizar tr\u00eas outras prote\u00ednas: a TcFCaBP (prote\u00edna flagelar de uni\u00e3o ao c\u00e1lcio), encontrada no flagelo do parasita; a TcMCU (uniporter de c\u00e1lcio mitocondrial), que foi identificada na mitoc\u00f4ndria; e a TcIP3<\/sub>R (receptor de inositol trifosfato), cuja localiza\u00e7\u00e3o foi confirmada no acidocalcisoma.<\/p>\n

\u201cEm rela\u00e7\u00e3o \u00e0 TcIP3<\/sub>R, havia uma disputa no meio acad\u00eamico sobre qual seria a localiza\u00e7\u00e3o correta. Um grupo do Jap\u00e3o coordenado por Katsuhiko Mikoshiba defendia a teoria de que ela estava no ret\u00edculo endoplasm\u00e1tico, enquanto Docampo dizia estar no acidocalcisoma, o que conseguimos confirmar\u201d, disse Lander.<\/p>\n

Desdobramentos<\/b><\/p>\n

Segundo a pesquisadora da Unicamp, al\u00e9m de p\u00f4r fim a um antigo embate, a descoberta tem diversas outras implica\u00e7\u00f5es, pois facilita a compreens\u00e3o dos processos de sinaliza\u00e7\u00e3o celular mediados pelo c\u00e1lcio no parasita.<\/p>\n

\u201cA sinaliza\u00e7\u00e3o por c\u00e1lcio \u00e9 importante para a sobreviv\u00eancia do parasita e interfere no seu potencial de infectar o hospedeiro. Sinais de c\u00e1lcio t\u00eam sido descritos como importantes para o processo de invas\u00e3o celular\u201d, explicou Lander.<\/p>\n

Atualmente, o grupo tem usado o sistema CRISPR\/Cas9 para estudar a fun\u00e7\u00e3o das prote\u00ednas TcMCU e TcIP3<\/sub>R e, assim, confirmar se a via de sinaliza\u00e7\u00e3o por c\u00e1lcio pode ser usada como alvo terap\u00eautico no T. cruzi<\/i>.<\/p>\n

\u201cO que fazemos basicamente \u00e9 nocautear o gene que codifica a prote\u00edna ou induzir sua superexpress\u00e3o. Em seguida, fazemos a caracteriza\u00e7\u00e3o fenot\u00edpica dessas linhagens mutantes\u201d, explicou.<\/p>\n

Parte dos experimentos do Projeto Tem\u00e1tico est\u00e1 sendo feita durante os\u00a0p\u00f3s-doutorados de Lander<\/b><\/a>\u00a0e de Miguel Angel Chiurillo<\/b><\/a> Siervo \u2013 ambos bolsistas da FAPESP.<\/p>\n

\u201cAo estudar a fun\u00e7\u00e3o de diversas prote\u00ednas envolvidas na sinaliza\u00e7\u00e3o por c\u00e1lcio, nosso objetivo \u00e9 identificar uma enzima ou rota metab\u00f3lica que seja essencial para o parasita e, ao mesmo tempo, n\u00e3o esteja presente em humanos. Assim, poderemos valid\u00e1-la como alvo terap\u00eautico\u201d, disse Lander.<\/p>\n

O artigo \u201cCRISPR\/Cas9-Induced Disruption of Paraflagellar Rod Protein 1 and 2 Genes in Trypanosoma cruzi<\/i> Reveals Their Role in Flagellar Attachment\u201d pode ser lido em http:\/\/mbio.asm.org\/content\/6\/4\/e01012-15.abstract<\/b><\/a>.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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